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細胞破碎的方法
更新時間:2021-02-19   點擊次數(shù):3222次

 

細胞破碎的方法
機械法  
 主要通過機械切力的作用使組織細胞破碎的方法,常用的器械有組織搗碎機、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。
1. 組織搗碎機
  將材料配成稀糊狀液,放置于筒內(nèi)約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調(diào)速器先撥至慢處,開動開關(guān)后,逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等,轉(zhuǎn)速可高達10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。
2. 勻漿器
  先將剪碎的組織置于管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料,除玻璃外,還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,適用于量少和動物臟器組織。
  存在的問題;較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌,較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器,質(zhì)地堅硬,易損傷勻漿閥,也不適合用該法處理。
3. 研缽
  多用于細菌或其他堅硬植物材料,研磨時常加入少量石英砂,玻璃粉或其他研磨劑,以提高研磨效果。
4. 細菌磨 
  是一種改良了的研磨器,比研缽具有更大的研磨面積,而且低部有出口。操作時先把細菌和研磨粉調(diào)成糊狀,每次加入一小勺,研磨20-30秒即可將細菌細胞*磨碎。
物理法
  主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有:
1. 反復(fù)凍溶法
  原理:因突然冷凍,細胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。
  方法:將待破碎的細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復(fù)幾次,由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結(jié)構(gòu)破碎。
  特點:此法適用于組織細胞,多用于動物性材料,對微生物細胞作用較差。
2. 急熱驟冷法
 將材料投入沸水中,維持85-90分鐘,至水浴中急速冷卻,此法可用于細菌及病毒材料。
3. 超聲波處理 
  用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震蕩破裂,此法多適用于微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,頻高于1520KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。其破碎機理:可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及首種類型等因素有關(guān)。
  特點:操作簡單,重復(fù)性較好,節(jié)省時間;多用于微生物和組織細胞的破碎。
  存在問題:超聲波破碎在實驗室規(guī)模應(yīng)用較普遍,處理少量樣品時操作簡便,液量損失少,但是超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞,散熱均有困難,應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用??栈饔檬羌毎茐牡闹苯釉?,同時會產(chǎn)生活性氧,所以要加一些巰基保護劑。
化學及生物化學法
1. 自溶法
  在一定PH和適當?shù)臏囟认?,利用組織細胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將。此過程需較長時間,常用少量防腐劑如甲苯、等防止細胞的污染。
2. 酶溶法
  利用各種水解酶,如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等,將細胞壁分解,使細胞內(nèi)含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感,加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后,使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。
  特點:
a) 此法適用多種微生物;
b) 具有作用條件溫和;
c) 內(nèi)含物成分不易受到破壞;
d) 細胞壁損壞的程度可以控制。
  存在的問題:易造成產(chǎn)物抑制作用,這可能是導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高,限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶,則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差,不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性,不適宜大量的蛋白質(zhì)提取,給進一步純化帶來困難。
3. 化學滲透法 
  某些有機溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。其作用機理;化學滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。
  特點:多用于破碎細菌,且作用比較溫和;提取核酸時,常用此法破碎細胞。
  存在的問題:時間長,效率低;化學試劑毒性較強,同時對產(chǎn)物也有毒害作用,進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑;通用性差:某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。
小結(jié)
  無論用哪一種方法破碎組織細胞,都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少,加入二異丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或減慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強度等,使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。
 介紹的幾種,可謂各有千秋,在實際應(yīng)用中,應(yīng)盡量考慮全面,選擇科學、有效的方法。|||順便提個問題:
關(guān)于反復(fù)凍融有很多資料,但是都不夠詳細,想請教做過這方面的酷友們
1、重懸緩沖液(裂解液?,PBS?
2、凍溶溫度(液氮?,-20,-80?
3、解凍溫度(37?,40
4、反復(fù)次數(shù)(3 次以上?)反復(fù)凍融實際上與超聲波破碎或酶解一起使用,否則凍融后黏度很大,蛋白質(zhì)容易聚集,通常都是反復(fù)凍融后超聲波處理,這樣效果比較好<br />
你問的幾個問題其實都沒有具體答案,緩沖液,溫度等都與具體蛋白質(zhì),具體實驗要求有關(guān),次數(shù)是基本達到你的要求即可
 
 

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